Los chips de diagnóstico basados ​​en CRISPR realizan miles de pruebas simultáneamente para detectar virus

Fuente: MIT News (The MIT community is driven by a shared purpose: to make a better world through education, research, and innovation. We are fun and quirky, elite but not elitist, inventive and artistic, obsessed with numbers, and welcoming to talented people regardless of where they come from.)

La plataforma de diagnóstico CARMEN combina microfluidos con la tecnología de detección SHERLOCK basada en CRISPR, y algún día podría usarse para esfuerzos de salud pública.

Los investigadores han desarrollado una nueva tecnología que escala de manera flexible los diagnósticos moleculares basados ​​en CRISPR, utilizando chips de microfluidos que pueden ejecutar miles de pruebas simultáneamente. La capacidad de un solo chip varía desde detectar un solo tipo de virus en más de 1,000 muestras a la vez hasta buscar en una pequeña cantidad de muestras más de 160 virus diferentes, incluido el virus Covid-19.

Esta tecnología, denominada Panel de reacciones combinatorias para la evaluación multiple de ácidos nucleicos (CARMEN: Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acids), validada en muestras de pacientes, proporciona resultados el mismo día y algún día podría aprovecharse para amplios esfuerzos de salud pública.

El trabajo aparece en Nature , dirigido por los primeros coautores Cheri Ackerman y Cameron Myhrvold , ambos becarios postdoctorales en el Broad Institute of MIT y Harvard. Paul Blainey , miembro principal del Broad Institute y profesor asociado en el Departamento de Ingeniería Biológica del MIT, y Pardis Sabeti , miembro del instituto de Broad, profesor de la Universidad de Harvard e investigador del Instituto Médico Howard Hughes, son coautores principales.

“La pandemia actual ha subrayado que las herramientas rápidas y sensibles son fundamentales para diagnosticar, vigilar y caracterizar una infección dentro de una población”, dijo Sabeti. “Se necesitan con urgencia diagnósticos innovadores que se puedan aplicar ampliamente en las comunidades”.

“Los diagnósticos basados ​​en CRISPR son una herramienta atractiva por su capacidad de programación, sensibilidad y facilidad de uso”, dijo Myhrvold. “Ahora, con una forma de ampliar estos diagnósticos, podemos explorar su potencial para enfoques integrales; por ejemplo, permitir que los médicos vean si los pacientes albergan múltiples infecciones, descartar un panel completo de enfermedades muy rápidamente o probar un gran población de pacientes por una infección grave «.

Miniaturización de diagnósticos CRISPR

Para construir una plataforma de prueba con esta capacidad, el equipo recurrió a los microfluidos, adaptando y mejorando la tecnología desarrollada en 2018 por el laboratorio de Blainey. Los investigadores crearon chips de goma, un poco más grandes que un teléfono inteligente, con decenas de miles de «micropocillos», pequeños compartimentos diseñados para contener un par de gotas del tamaño de un nanolitro. Una gota contiene material genético viral de una muestra y la otra contiene reactivos de detección de virus.

“Los chips de micropocillos están hechos como un sello, es goma vertida sobre un molde”, explicó Ackerman. «Podemos replicar y compartir fácilmente esta tecnología con colaboradores».

El enfoque de detección utilizado en los chips está adaptado del SHERLOCK de diagnóstico basado en CRISPR, descrito por primera vez en 2017 y desarrollado por un equipo de científicos del Broad Institute, el McGovern Institute for Brain Research en MIT, el Institute for Medical Engineering & Science en MIT y el Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica de la Universidad de Harvard.

Para utilizar la plataforma CARMEN, los investigadores primero extraen el ARN viral de las muestras y hacen copias de este material genético, de manera similar al proceso de preparación para los diagnósticos RT-qPCR que se utilizan actualmente para los casos sospechosos de COVID-19. Luego, los investigadores agregan un tinte de color fluorescente único a cada muestra preparada y dividen la mezcla en pequeñas gotas.

Las mezclas de detección, por otro lado, contienen la proteína CRISPR Cas13 , un ARN guía que busca una secuencia viral específica y moléculas para informar los resultados. Estas mezclas también están codificadas por colores y separadas en gotitas.

A continuación, se agrupan miles de gotas de las muestras y las mezclas de detección y se cargan en un chip en un solo paso de pipeteo. Cada micropocillo del chip atrapa dos gotas. Cuando una gota de detección encuentra su objetivo, una secuencia genética viral específica, en una gota de muestra en el mismo micropocillo, un microscopio de fluorescencia produce y detecta una señal. El protocolo completo, desde la extracción de ARN hasta los resultados, toma menos de ocho horas.

“Unir estas dos tecnologías en una sola plataforma nos brinda nuevas y emocionantes capacidades para investigar cuestiones clínicas y epidemiológicas”, dijo el coautor Gowtham Thakku, estudiante graduado del MIT en el Programa de Microbioma y Enfermedades Infecciosas de Broad.

CARMEN permite más de 4.500 pruebas en un solo chip de microfluidos, que puede aplicarse a muestras de pacientes de diversas formas utilizando los códigos fluorescentes disponibles. Por ejemplo, un solo chip podría analizar simultáneamente 1.048 muestras para un solo virus, o cinco muestras para 169 virus. La capacidad se puede ampliar fácilmente añadiendo más chips: «Normalmente ejecutamos cuatro o cinco chips en un solo día», señaló Ackerman.

Capacidades de multiplexación

Para mostrar las capacidades de diagnóstico múltiple de la plataforma, el equipo desarrolló una estrategia para probar rápidamente docenas de muestras para los 169 virus asociados con humanos que tienen más de 10 secuencias genómicas publicadas. Los investigadores probaron este panel de detección contra 58 muestras de pacientes, utilizando varios chips. Además, aplicaron CARMEN en muestras de pacientes para diferenciar los subtipos de cepas de influenza A y detectar mutaciones de resistencia a los medicamentos en el VIH.

El equipo también incorporó mezclas de detección para SARS-CoV-2, el virus que causa Covid-19, y otros patógenos respiratorios para demostrar, utilizando secuencias virales sintéticas, cómo el ensayo se puede adaptar rápidamente para detectar virus emergentes.

“CARMEN ofrece un rendimiento y una flexibilidad impresionantes en las pruebas de diagnóstico”, dijo la coautora Catherine Freije , estudiante de posgrado de Harvard en el laboratorio Sabeti.

Los investigadores informan que la sensibilidad de la plataforma es comparable a los ensayos SHERLOCK publicados anteriormente, y continúan mejorando y validando CARMEN utilizando muestras clínicas adicionales. Junto con los datos de pruebas exitosos de muestras de pacientes descritos en Nature hoy, este enfoque podría traducirse fácilmente en la clínica, según el equipo.

«Este enfoque miniaturizado de diagnóstico es eficiente en el uso de recursos y fácil de implementar», dijo Blainey. “Las nuevas herramientas requieren creatividad e innovación, y con estos avances en química y microfluidos, estamos entusiasmados con el potencial de CARMEN mientras la comunidad trabaja para combatir tanto el COVID-19 como las futuras amenazas de enfermedades infecciosas”.

El apoyo para este estudio fue proporcionado en parte por Howard Hughes Medical Institute, el Koch Institute for Integrative Cancer-Harvard Cancer Center Research Bridge Project, un MIT Deshpande Center Innovation Award, el Merkin Institute for Transformative Technologies in Healthcare, un Burroughs Wellcome Fund CASI Award , la subvención D18AC00006 de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA) y el NIH (F32CA236425).